키틴 합성효소의 구조, 촉매작용, 키틴 수송 및 선택적 억제

Nature Communications 14권, 기사 번호: 4776(2023) 이 기사 인용

1927년 접속

13 알트메트릭

측정항목 세부정보

키틴은 가장 풍부한 천연 생체고분자 중 하나이며 곰팡이 세포벽과 곤충 외골격을 포함한 세포외 기질의 중요한 구조적 구성 요소 역할을 합니다. β-(1,4)-연결된 N-아세틸글루코사민의 선형 중합체인 키틴은 키틴 합성효소에 의해 합성되며, 이는 항진균제 및 항곤충제의 표적으로 인식됩니다. 이 연구에서 우리는 글리코실 기증자, 수용체, 생성물 또는 펩티딜 뉴클레오시드 억제제의 부재 및 존재 하에서 Saccharomyces cerevisiae 키틴 신타제의 7가지 서로 다른 저온 전자 현미경 구조를 결정합니다. 기능적 분석과 결합된 이러한 구조는 기증자와 수용체 기질이 활성 부위에 결합하는 방법, 기질 가수분해가 자가 프라이밍을 유도하는 방법, 키틴 전도성 막관통 채널이 열리는 방법, 펩티딜 뉴클레오시드 억제제가 키틴 합성효소를 억제하는 방법을 보여줍니다. 우리의 연구는 키틴 합성효소의 기능과 억제를 이해하기 위한 구조적 기초를 제공합니다.

키틴은 지구상에서 셀룰로오스 다음으로 두 번째로 풍부한 천연 다당류이며, 매년 살아있는 유기체에 의해 약 1,000억 톤의 키틴이 생산됩니다1. 키틴은 갑각류와 곤충의 외골격인 곰팡이 세포벽의 주요 구성 요소이며 이러한 유기체의 번식, 성장 또는 발달에 필수적인 역할을 합니다2. 키틴은 β-(1,4)-연결된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 장쇄 폴리머이며 원형질막3,4에서 키틴 합성효소에 의해 합성됩니다. 키틴 합성효소는 UDP 활성화 GlcNAc(UDP-GlcNAc)를 설탕 공여체로 사용하여 키틴의 β(1 → 4) 글리코시드 결합 형성을 촉매하고 동시에 다당류 생성물을 막을 통해 외부로 운반합니다(그림 1a).

Chs1에 의한 키틴의 합성 및 수송 계획. b GlcNAc가 포함된(WT) 또는 포함되지 않은(GlcNAc 없음) 완충액에서 정제된 Chs1을 사용한 시험관 내 UDP-Glo 글리코실트랜스퍼라제 분석. WT 조건에서의 분석은 EDTA, 트립신, NikkoZ 또는 PolyB를 사용하여 수행되었습니다. Chs1이 없는 반응이 대조군으로 사용되었습니다. 데이터 포인트는 평균 ± SD를 3중으로 나타냅니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다. c GlcNAc가 포함된(WT) 또는 포함되지 않은(noGlcNAc) 완충액에서 정제된 Chs1을 사용한 시험관 내 키틴 합성 분석. WT 조건 하에서의 분석은 EDTA 및 트립신을 사용하여 수행되었습니다. Chs1이 없는 반응이 대조군으로 사용되었습니다. 데이터 포인트는 평균 ± SD를 3중으로 나타냅니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다. d Cryo-EM 맵과 apo Chs1 이합체의 원자 모델. e Chs1 단량체의 만화 표현. 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 무지개색으로 표시됩니다. 추정 활성 사이트는 주황색 원으로 강조 표시됩니다. 추정되는 키틴 운반 채널은 보라색 화살표로 표시됩니다. f Chs1 단량체의 만화 토폴로지. g Chs1 도메인 맵. 주요 도메인과 모티프가 표시되어 있습니다. 보이지 않는 N 말단 영역은 흰색입니다.

Saccharomyces cerevisiae에서 키틴 합성효소는 주로 CHS1, CHS2 또는 CHS3에 의해 인코딩됩니다. 세 가지 유전자 모두의 동시 녹아웃은 효모에서 치명적입니다5. ScChs1과 ScChs2는 ScChs36과 다른 수의 막횡단 나선을 포함하는 동일한 키틴 합성효소 계열에 속합니다. ScChs1과 ScChs2는 일차 격막을 합성하고 세포질 분열에서 세포 분리와 관련이 있는 반면, ScChs3은 새싹 고리의 키틴과 세포벽에 분산된 키틴의 형성을 담당합니다5,7,8,9,10,11. 이전 연구에 따르면 Chs1은 주로 자이모겐 형태이며 단백질 분해에 의해 활성화될 수 있습니다.

키틴 합성효소는 히알루로난 및 셀룰로오스 합성효소도 포함하는 GT-A 접힘 함유 반전 글리코실트랜스퍼라제 2 계열에 속합니다. 최근 몇 년 동안 히알루로난 및 셀룰로오스 합성효소의 구조가 보고되어 작동 메커니즘에 대한 구조적 통찰력을 제공합니다. 그러나 키틴 합성효소의 구조는 아직 밝혀지지 않았으며, 이는 키틴 합성효소의 촉매 및 키틴 수송 메커니즘에 대한 기계적 이해를 방해합니다.

2000 cells were counted and calculated using w303 and chs1Δ as negative and positive controls. The phenotype of the cell string is an indicator of how much Chs1’s function is disrupted in vivo. d Structural comparison between UDP-GlcNAc donor-bound Chs1 (purple) and primed UDP+GlcNAc-bound Chs1 (cyan) by aligning their TMs. The orange arrow marks the shift of the GT domain and nucleotide toward the membrane from the donor-bound state to the primed state. The active site is highlighted by a blue rectangle. The sugar donor is highlighted by a yellow rectangle. e Close-up view of the active site of primed Chs1 (cyan) in complex with UDP, GlcNAc, and two Mg2+ ions (lime). This is enlargement of the blue rectangle in (d) viewed from left. Substrates and key residues are shown in stick representation. f Enlargement of the yellow rectangle in (d) viewed from back. The UDP (cyan) and Mg2+ (lime) of primed Chs1, and UDP-GlcNAc (purple) and Mg2+ (purple) of the donor-bound Chs1 are shown. α-, β-phosphates are labeled, highlighting a 180° rotation of the β-phosphate from UDP-GlcNAc to UDP./p>4 Å. This is probably partially because the conserved metal coordinate DxD motif in other metal-dependent GT-A fold glycosyltransferases33 is replaced by a DAG motif (residues 602–604) in Chs1 (Fig. 3a, Supplementary Fig. 14). Such architecture of Mg2+ enables the movement of β-phosphate./p>

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